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天然支架材料在牙髓组织工程再生中的研究进展

发布日期:2019-12-01 06:01   来源:未知   阅读:

  个条件:干细胞、生长因子及支架。其中,支架扮演着重要作用,可作为细胞运输的载体,为细胞代谢提供三维空间环境,并在细胞外基质的形成过程中被逐步降解。理想的牙髓再生组织工程支架应最大程度对牙髓组织中的细胞外基质进行仿生,具有以下特点:1)良好的生物相容性及生物安全性;2)可降解,降解产物无毒无害,降解的速率与胞外基质的形成速率相匹配;3)具有疏松多孔的结构,孔隙率适宜,空隙之间相互联通,有利于细胞的黏附、营养及代谢产物的转运;4)理想的表面特性,有利于细胞的黏附;5)可通过一系列分子信号影响细胞的行为及诱导特异表型的表达;6)由于感染根管内的感染无法完全去除,支架材料应该具备一定的抗感染能力。

  目前应用于牙髓再生研究的支架材料主要有人工合成高分子材料及天然材料两大类。人工合成高分子材料通常具有较好的力学强度及加工性能,但亲水性和细胞活性较差,体内降解缓慢,目前仅见体外培养、裸鼠皮下移植、小鼠冠髓切除后部分牙髓再生,尚未见人体应用。天然材料是指从动植物组织中提取的可降解材料,其特点是与细胞外基质相似度高,或本身就是细胞外基质的组成部分,通常具有良好的生物活性、亲水性、材料与细胞界面相容性。目前利用天然材料进行牙髓再生已有成功的临床病例及相关的动物实验,本文将对常用天然材料在牙髓组织工程再生中的研究进展作一综述。

  胶原是人体最主要的结构蛋白,目前已鉴定的胶原有19种,组织工程常用的为Ⅰ型胶原。胶原不溶于水,但可在稀酸中发生溶胀而形成胶体,处于溶胀状态的胶原又可在一定条件下重新交联而形成凝胶。胶原是一种抗原性极弱的蛋白质,通过酶解法提取可进一步降低其抗原性。研究表明:作为胞外基质的主要成分,胶原不仅为细胞提供一个简单的附着支架,同时也是细胞信息的载体,可与细胞之间进行分子信号的传递,进而影响细胞的生物学行为。

  目前,应用于牙髓再生的胶原主要从牛或猪的皮肤及腱鞘中提取,保持了天然空间结构的块状胶原,作为可吸收基质应用于牙髓血运重建术,有促进凝血的作用并为三氧化矿物聚合物(mineral trioxide aggregrate,MTA)的冠方充填提供支持。胶原在牙髓再生治疗中的优势主要为人体应用成熟,有商用胶原支架材料,如Colla-Plug、Collacote、CollaTape等;有成功的临床病例支持其效果,但适应证仅限于根尖孔未闭合的年轻恒牙;可制成水凝胶,有通过注射的方式进行牙髓再生治疗的可能性,临床应用方便;缺点为力学性能差,降解速率较快,但是由于牙髓组织本身不需要受力,牙髓再生对于支架材料的力学性能要求较低,这部分弥补了胶原支架的缺陷。

  胶原是目前在牙髓再生中应用前景最为理想的支架材料,对胶原的研究主要集中在对材料进行改性,进一步扩展细胞运载能力及增加生物刺激,促进细胞的黏附、增殖、分化等;对其他材料进行表面改性,如对聚乳酸进行胶原表面覆盖,结合了聚乳酸良好的加工性能及胶原良好的亲水性及生物活性;尝试应用凝胶态胶原,结合干细胞及生长因子,拓宽牙髓再生治疗的适应证,如根管治疗后的成熟恒牙、底侧穿修复等;应用胶原作为支架,尝试通过干细胞疗法再生牙髓,一些学者利用去端肽胶原作为组织支架,率先进行了牙髓再生干细胞疗法的前期临床试验,取得了一定的效果,5例发育成熟后感染不可逆性牙髓炎的单根牙中,4例检测到了牙髓电活力阳性,3例可观察到功能性牙本质的产生。

  19世纪60年代,Ostby由血凝块形成是身体其他部位组织缺损修复的起始得到启发,率先尝试了在扩大根尖孔的根管内引进血凝块进行牙髓再生,观察一段时间后,临床可见症状消除,影像学可见根尖孔闭合,组织学检查见根管内形成结缔组织,但未见成牙本质细胞。Ostby开启了通过根尖区引血进行牙髓再生的大门,并逐渐演化成了现在的牙髓血运重建术,应用于根尖孔未发育成熟的年轻恒牙,取得了较好的临床效果。

  血凝块取材方便,不需要体外操作,通过引血可以带入一定量的干细胞,血液凝固后可形成三维的纤维支架,本身即包含了生长因子,是优异的牙髓再生天然支架,但仍受到某些缺陷的限制,如某些情况引血较为困难、生长因子浓度不够高、血细胞死亡后释放出的酶可能会影响干细胞生长等。

  PRP是利用血液中各个组分沉降系数不同,通过将全血梯度离心制得的血小板浓缩产品,其血小板的浓度是全血的4~5倍。通过血小板脱颗粒和凝血作用,PRP可形成纤维蛋白三维支架并释放大量生长因子和蛋白质等生物活性因子,这些活性因子可以参与细胞的迁移、增殖、分化,具有调节免疫应答和组织愈合的作用。通过改变制备工艺可以使PRP含有一定量的白细胞,使其具有一定的免疫防御及炎症对抗效果。

  PRF是继PFP之后的新一代血小板浓缩产品,具有与PRP相似的优点,不同的是在制备过程中,PRF不需要添加任何外源性添加物,保存了更多的纤维蛋白原,这使得PRF避免了外源性添加物(如抗凝剂等)潜在的免疫原性和对于组织再生的抑制作用。PRF凝血过程及生长因子释放过程更加接近生理状态,产生的纤维蛋白支架更加艰韧有弹性,生长因子的释放更加匀速持久。

  由于PRF在制备过程中不添加外源性的抗凝剂,在抽血后的数分钟内就会形成纤维蛋白凝块,因此,通常情况下,PRP以液状、PRF以凝胶状作为组织工程支架,这限制了PRF在不规则区域(如根管)组织工程中的应用。近年来,通过对制备工艺的改进,如降低离心转速等,已有学者开发出了可注射的PRF,让PRF在可注射的同时具有更高含量的血小板、白细胞及生长因子。

  应用于牙髓再生,PRP和PRF可单独或者结合血凝块应用于牙髓血运重建术,临床治疗过程和组织再生方式与单独使用血凝块相似,均有成功的临床病例报道,通过动物实验进行的组织学研究进一步证实了PRP、PRF应用于牙髓再生的效果,但是对于血凝块、PRP、PRF应用血运重建的效果优劣比较目前尚无定论。尚未见可注射PRF应用于牙髓再生的报道。

  壳聚糖又称脱乙酰甲壳素,由广泛存在于甲壳类动物外壳中的几丁质经过脱乙酰作用制成。壳聚糖结构中的N-乙酰基葡糖胺广泛存在于细胞外基质的糖胺聚糖中,具有和糖胺聚糖类似的生物活性。壳聚糖无毒、无刺激,生物安全性优良,是一种带正电荷、高电荷密度的碱性多糖,金蛇霸王三肖。能与许多水溶性带负电荷的物质(如DNA、糖胺聚糖、糖蛋白等)生成聚合物。植入体内后,在生理pH条件下,聚合物可部分解离,这使得壳聚糖可作为带负电荷的生物活性物质的控释载体。

  壳聚糖还可表现出类似抗生素的广谱抗菌作用,有利于根管消毒。但壳聚糖本身降解速率较缓慢,且无法调节,加工性能差,这限制了壳聚糖作为组织工程生物支架的使用。2014年,Li等将壳聚糖制成一面致密、一面疏松的双层膜结构,并在疏松面运载转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1),在比格犬上进行直接盖髓实验。观察到在运载了TGF-β1的壳聚糖膜下能够形成更多的类成牙本质细胞,60 d后形成的修复性牙本质厚度为其他的3倍。

  随后,Farea等也发现:壳聚糖支架与TGF-β1具有协同作用,可共同促进脱落乳牙牙髓干细胞(stem cell from human exfoliated deciduousteeth,SHED)的增殖及成牙本质向分化。Soares等将壳聚糖和胶原共同制成多孔支架,以铝酸钙进行表面处理,接种牙髓干细胞后发现:相较于未进行表面处理的壳聚糖-胶原支架,进行表面处理后细胞黏附增殖更快,培养14 d后可见更多的基质矿物沉积及矿化相关基因的表达。目前的研究表明:如能克服或改善其缺点,壳聚糖具有相当广阔的应用于牙髓再生的前景。

  透明质酸是由N-乙酰氨基葡萄糖和D-葡萄糖醛酸交联而成的天然线性多糖化合物,亲水性良好,是细胞外基质的主要成分,具有良好的生物相容性、降解性和非免疫原性。研究表明:透明质酸可以诱导碱性磷酸酶的分泌,上调骨钙素表达,与地塞米松、重组人骨形态发生蛋白-2相互作用,在骨髓基质细胞迁移、黏附、增殖、分化等方面发挥着重要作用。透明质酸能形成连续的三维蜂窝状网络结构,以水凝胶的形式作为组织工程支架,还可通过冷冻干燥技术制备成孔隙率更高,力学性、弹性性能更好的固相网络支架材料。

  应用透明质酸作为支架材料面临的主要问题是高水溶性;对自由基及透明质酸酶敏感,易发生降解;吸收迅速,在体内保留时间短;在水体系中缺乏力学强度。透明质酸在体外实验中对牙髓干细胞牙髓向分化有促进作用,但缺乏进一步的动物实验及人体试验,透明质酸虽具有应用于牙髓再生的潜能,但仍需要进一步的研究。Ferroni等在透明质酸支架接种牙髓干细胞后进行三维培养,前后加入了成神经、成神经胶质、成上皮、成骨相关刺激因子,旨在通过三维培养中加入多种细胞刺激生长来构建一个多细胞种类的类牙髓组织;体外培养21 d后,可见多种细胞分化相关因子的表达,提示牙髓干细胞向着多种细胞种类分化,支架表面及支架之间可见细胞外基质形成。

  Chrepa等对比了商用透明质酸水凝胶(restylane)和基底膜基质(matrigel)作为牙髓组织工程支架的效果,结果发现:在3 d的培养时间内,2种支架材料均降低了细胞活性,但透明质酸培养3 d后细胞活性显著增高,且培养7 d后,透明质酸组的碱性磷酸酶活性更高,牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)、牙本质基质蛋白(dentinmatrix protein,DMP)-1、细胞外基质磷酸糖蛋白(matrix extracellular phosphoglycoprotein,MEPE)基因表达量更高。

  Inuyama等分别将透明质酸和胶原支架充填入冠髓切除后的小鼠磨牙内,对比了透明质酸和胶原应用于牙髓再生的效果差异,结果发现:两者效果相似,均有类牙髓组织形成,但透明质酸细胞密度更高,且粒细胞浸润更少。

  丝蛋白是将蚕丝或蛛丝提纯,去除糖基化蛋白后制备成的天然高分子材料。去除糖基化蛋白的丝蛋白具有良好的生物相容性,可通过丝蛋白中晶状β-折叠片层结构的比例调整材料的力学性能、降解和吸收的速率,这为在支架材料的降解时间与干细胞的增殖分化的时间之间建立理想的匹配关系提供了可能。丝蛋白细胞黏附性良好,可能缘于丝蛋白肽链的C端亲水区域附近带有正电荷,而哺乳动物的细胞表面主要为带负电荷的基团,两者可相互吸引。丝蛋白肽链上还有大量重复的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列,可作为哺乳动物细胞黏附识别位点。

  目前,对于丝蛋白在牙髓组织工程再生中的应用研究较少,但相较于大多数天然可降解材料,丝蛋白表现出了力学性能良好、可加工性能强等优势,未来是否可利用丝蛋白加工性能较强的特点促进牙髓再生效果仍需进一步的研究。相关的研究有2015年Yang等利用丝蛋白多孔支架制成牙片模型,并对比了碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,b-FGF)对牙髓干细胞增殖分化的影响,研究发现:体外培养28 d后,牙髓干细胞可在支架表面进行增殖,在支架表面和空隙之间可见矿物沉积,b-FGF的加入可以显著提高细胞增殖速率及增加矿物形成。裸鼠皮下植入7周后,b-FGF-细胞-支架组可见类牙髓样组织生成,组织血管化良好,类牙本质细胞在牙本质表面集中排列,有新生的矿化组织生成。细胞-支架组亦可见血管化的结缔组织生成,但细胞排列紊乱,未见矿物沉积生成。

  尽管已经有一系列的支架材料运用于牙髓组织工程再生,但是目前尚没有一种支架可以完全模仿牙髓组织中的天然胞外基质,为细胞提供最接近自然状态的力学支持及局部微环境。因此,静心阁开奖559955资料开奖有学者尝试通过将牙髓脱细胞后或牙本质脱矿后制成支架,最大程度模仿牙髓细胞生存代谢的天然微环境。Ravindran等将人牙髓干细胞、人骨髓基质细胞、人牙周膜细胞分别接种于脱细胞牙髓支架,观察2周后发现:3种干细胞均可以在脱细胞牙髓支架表面黏附、增殖良好,在不额外添加生长因子的情况下,脱细胞牙髓支架可以单独促使3种细胞向成牙本质细胞向分化。

  Tran等将牙本质切块并去除玷污层后作为支架与人牙髓干细胞共培养,结果发现:经过处理后的牙本质可观测到DMP的析出,细胞在牙本质表面分化增殖良好,胞外基质形成的同时伴有类牙本质生成。最新的研究中,Song等对比了3种不同方法制成的脱细胞牙髓支架,结果发现:牙髓脱细胞后都会造成细胞骨架蛋白和膜蛋白的完全破坏,胶原之间的交联程度轻微改变,且主要集中在牙髓成牙本质细胞层。从中筛选出结构破坏最小的支架后,将脱细胞牙髓支架、离体牙制成1 mm厚牙片模型,接种根尖周牙乳头干细胞(stem cell fromthe apical papilla,SCAP)培养2周后,结果发现:SCAP分化成大量纺锤样细胞,接近牙本质的SCAP形态更加扁平,且伸出突起进入牙本质小管。

  虽然脱细胞牙髓支架是与自然状态最接近的支架材料,体外实验效果良好,但是应用于人体将面临材料来源有限、异体应用免疫原性的困境,因此其应用更多的属于理论研究。该方面的研究表明:根管周围的牙本质不但可以作为细胞支架,还可以作为一个细胞因子的来源,对其进行适当的处理有助于提升牙髓再生的效果。

  得益于牙髓组织本身不需要受力,以及牙髓周围硬组织的包绕,牙髓再生对于材料力学性能要求较低,这给了天然材料更加广阔的应用空间。在众多天然材料中,血凝块、PRP、PRF以及胶原支架是目前应用较为理想的材料,且均以牙髓血运重建术的成功开展为前提,具有代表性。其他天然材料的应用尚需临床试验的验证。而干细胞结合支架的前期临床研究,为支架应用提供了新的思路。

  来源:李龙飚,汪成林,叶玲.天然支架材料在牙髓组织工程再生中的研究进展[J].国际口腔医学杂志,2018,45(06):666-672.

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